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生产用微生物菌种的改良方法

信息来源:泰安大同不凡生物工程有限公司  发布时间:2021/9/25 15:54:23  浏览量:855 次


采用合适的筛选方法,诱变育种可以获得高产菌株。但不能达到定向育种的目的。随着现代生物技术的发展,常规的杂交育种,原生质体融合,DNA重组可达到改良菌种的目的。 

  

杂交育种一般指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合,再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。真菌、放线菌和细菌均可进行杂交育种。杂交育种是选用已知性状的供体菌株和受体菌株作为亲本,把不同菌株的优良性状集中于组合体中。因此,杂交育种具有定向育种的性质。杂交后的杂种不仅能克服原有菌种生活力衰退的趋势,而且,杂交使得遗传物质重新组合,动摇了菌种的遗传基础,使得菌种对诱变剂更为敏感。因此,杂交育种可以消除某一菌种经长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象。通过杂交还可以改变产品质量和产量,甚至形成新的品种。总之,杂交育种是一种重要的育种手段。但是,由于操作方法较复杂、技术条件要求较高,其推广和应用受到一定程度的限制。杂交育种主要有常规的杂交育种和原生质体融合这两种方法,近年来,后一种方法较为多见。


常规的杂交育种

常规的杂交育种不需用脱壁酶处理,就能使细胞接合而发生遗传物质重新组合。现以青霉菌的杂交育种为例,说明杂交的主要过程。青霉菌的杂交过程实际上也是青霉菌准性生殖的过程。


⒈ 遗传标记 

  杂交育种所用的亲本菌株通常要有一定的遗传标记以便于筛选。可作为青霉菌亲本菌株的遗传标记有许多种,如营养缺陷型、抗药性突变型等等。其中以营养缺陷型作为遗传标记为常见,下面叙述的杂交方法就是以营养缺陷型作为遗传标记的。通常是将两个用来杂交的野生型菌株,经过诱变得到两株不同的营养缺陷型作为杂交的直接亲本菌株。 

  

⒉ 异核体形成 

  要获得异核体有许多种方法,这里仅介绍完全培养基混合培养法。将两个直接亲本(营养缺陷型)的孢子混合接种于液体完全培养基中,培养1~2天,挑出生长的菌丝体,用液体基本培养基或生理盐水离心洗涤3次,将菌丝取出、撕碎,置于基本培养基平板上培养7天,由菌丝碎片长出的菌丝即为异核体。异核体是两个直接亲本菌株经过细胞间的接合而形成的,即在一条菌丝里含有两个遗传特性不同的细胞核,共同生活在均一的细胞质里(质配),能够互补营养,因此能在基本培养基上生长。 

  

⒊ 杂合二倍体的形成 

  杂合二倍体是杂交育种的关键。因为杂合二倍体本身不仅已经具备了杂种的特性,而且随着其染色体或基因的重组和分离,还能形成更多类型的杂种(重组体分离子),这就为杂交育种提供了丰富的材料。 
  杂合二倍体形成的方法是在基本培养基平板上分离异核体所产生的分生孢子,在异核体的分生孢子里偶尔有两个遗传性状不同的细胞核发生了融合,这样就形成了杂合二倍核(核配),这个杂合二倍核经过繁殖,就可以得到杂合二倍体。杂合二倍体的营养要求、分生孢子的颜色以及生长习性都与野生型相近似,其孢子体积和DNA含量明显大于其直接亲本。杂合二倍体菌株与单倍体菌株(亲本菌株)相比,具有较高的酶活性,生长速率和糖的利用速率比较快。但异核体自发形成杂合二倍体的频率很低,因此人为地提高形成杂合二倍体的频率。常用的方法有:提高异核体的培养温度,用紫外线照射异核体,用樟脑蒸气熏异核体菌丝等。 

  

⒋ 染色体交换和单倍化 

  杂合二倍体一般是稳定的,但也有极少数杂合二倍体的细胞核在它们无性繁殖的细胞分裂过程中偶然发生染色体交换和单倍化,产生很多类型的二倍或单倍分离子。用诱变剂处理则分离子的类型更多,这些分离子从表型上可以分为亲本型分离子和重组型分离子两种。重组型分离子在二倍体菌落中表现为角变和扇形斑点。青霉菌杂交的目的是为了获得重组型分离子。

原生质体融合 

  原生质体融合一般包括标记菌株的筛选、原生质体的制备、原生质体的融合、融合子的选择、实用性菌株的筛选等。图4-9为原生质体融合的基本过程示意图。

 

原生质体融合育种主要步骤如下:选择两个有特殊价值并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本,在高渗透压溶液中,用适当的脱壁酶去除细胞壁,剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。这时原生质体对溶液和培养基的渗透压非常敏感,在高渗透压或等渗透压的溶液或培养基中才能维持其生存,在低渗透压溶液中将会破裂而死亡。两种不同的原生质体在高渗透压条件下混合,在助融剂聚乙二醇(PEG)和Ca2+作用下,发生细胞膜的结合。在融合时两亲本基因组由接触到交换,从而实现遗传重组,再生的细胞菌落中就有可能获得具有理想性状的重组菌株。 

  

原生质体自发融合的频率极低,为了提高原生质体的融合率,往往要加入助融剂——聚乙二醇(PEG)。PEG可使原生质体的膜电位下降,然后原生质体通过Ca2+交换而促进凝集。另外,PEG是一种脱水剂,由于脱水作用,扰乱了分散在原生质体膜表面的蛋白质和脂质的排列,提高了脂质胶粒的流动性,原生质体开始聚集收缩,相邻的原生质体融合的大部分面积紧密接触。开始原生质体融合仅在接触部位的一小块区域,形成细小的原生质桥,继而逐渐变大导致两个原生质体融合。 

  

原生质体无细胞壁,易于接受外来遗传物质,不仅可能将不同种的微生物融合在一起,而且可能使亲缘关系更远的微生物融合在一起。原生质体易于受到诱变剂的作用,而成为较好的诱变对象。实践证明,原生质体融合能使重组频率大大提高。因此,通过此项技术能使来自不同菌株的多种优良性状,通过遗传重组,组合到一个重组菌株中。原生质体融合作为一项新的生物技术,为微生物育种工作提供了一条新的途径。现将原生质体融合过程简介如下。


⒈ 标记菌株的筛选 
  供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记,以利于融合子的选择。采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。 
  对两亲株的抗性标记进行筛选。因为在原生质体的融合中,所用的亲株均要有一定的标记,以便于筛选。当然,所需的目的基因并不一定与标记基因连锁,但它毕竟可以大大减少工作量,提高育种效率。通过采用多种抗生素及其他药物,以梯度平板法进行粗选,再用具有抗性的微生物涂布不同浓度的药物平板,进行较细的筛选。 

  

⒉ 原生质体的制备 

  获得有活力、去壁较为完全的原生质体对于随后的原生质体融合和原生质体再生是非常重要的。制备原生质体的脱壁酶只能采用滤菌器去菌,对于细菌和放线菌,主要采用溶菌酶;对于酵母菌和霉菌,则一般采用蜗牛酶和纤维素酶。影响原生质体制备的因素有许多,主要有以下几个方面。 
  ⑴ 菌体的预处理 在使用脱壁酶处理菌体以前,先用某些化合物对菌体进行预处理,有利于原生质体制备。例如用EDTA(乙二胺四乙酸)、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等处理细菌,可使菌体的细胞壁对酶的敏感性增加。EDTA能与多种金属离子形成络合物,避免金属离子对酶的控制作用而提高酶的脱壁效果。甘氨酸可以代替丙氨酸参与细胞壁肽聚糖的合成,其结果干扰了细胞壁肽聚糖的相互交联,便于原生质体化。 
  ⑵ 菌体的培养时间 为了使菌体细胞易于原生质体化,一般选择对数生长期后期的菌体进行酶处理。这时的细胞正在生长、代谢旺盛,细胞壁对酶解作用最为敏感。采用这个时期的菌体制备原生质体,原生质体形成率高,再生率亦很高。 
  ⑶ 酶浓度 一般地说,酶浓度增加,原生质体的形成率亦增大,超过一定范围,则原生质体形成率提高不明显。酶浓度过低,则不利于原生质体的形成;酶浓度过高,则导致原生质体再生率的降低。为了兼顾原生质体形成率和再生率,有人建议以使原生质体形成率和再生率之乘积达到最大时的酶浓度为最适酶浓度。 
  ⑷ 酶解温度 温度对酶解作用有双重影响,一方面随着温度升高,酶解反应速度加快;另一方面,随着温度升高,酶蛋白变性而使酶失活。一般酶解温度控制在20~40 ℃。 
  ⑸ 酶解时间 充足的酶解时间是原生质体化的必要条件。但是如果酶解时间过长,则再生率随酶解的时间延长而显著降低。其原因是当酶解达到一定的时间后,绝大多数的菌体细胞均已形成原生质体,因此,再进行酶解作用,酶便会进一步对原生质体发生作用而使细胞质膜受到损伤,造成原生质体失活。 
  ⑹ 渗透压稳定剂 原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感,在高渗透压或等渗透压的溶液或培养基中才能维持其生存,在低渗透压溶液中,原生质体将会破裂而死亡。对于不同的菌种,采用的渗透压稳定剂不同。对于细菌或放线菌,一般采用蔗糖、丁二酸钠等为渗透压稳定剂;对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等;对于霉菌则采用KCl和NaCl等。稳定剂的使用浓度一般为0.3~0.8 mol/L。一定浓度的Ca2+、Mg2+等二价阳离子可增加原生质膜的稳定性,所以是高渗透压培养基中不可缺少的成分。

⒊ 原生质体的融合与再生 
  融合是把两个亲株的原生质体混合在一起,在融合剂PEG和Ca2+作用下,发生原生质体的融合。获得有活力、脱壁较为完全的原生质体是原生质体融合的先决条件;而原生质体融合后的重组子要成为一个无性繁殖系,首先再生,即能重建细胞壁,恢复完整细胞并能生长、分裂,这是原生质体融合的必要条件。影响原生质体融合的因素主要有:菌体的前处理、菌体的培养时间、融合剂的浓度、融合剂作用的时间、阳离子的浓度、融合的温度及体系的pH值等。影响原生质体再生的因素有:菌种自身的再生性能、原生质体制备的条件、再生培养基成分、再生培养条件等。 
  检查原生质体形成和再生的指标有两个,即原生质体的形成率和原生质体的再生率,可以通过如下方法来求得: 
  ⑴ 将用酶处理前的菌体经无菌水系列稀释,涂布于完全培养基平板上培养,计出原菌数,设该数值为A。 
  ⑵ 将用酶处理后得到原生质体分别经如下两个过程的处理。① 用无菌水适当稀释,在完全培养基平板上培养计数,由于原生质体在低渗透压条件下会破裂失活,所以生长出的菌落数为未形成原生质体的原菌数,设该值为B。② 用高渗透压液适当稀释,在再生培养基平板上培养计数,生长出的菌落数为原生质体再生的菌数和未形成原生质体的原菌数之和,设该数值为C。以原生质体形成率和再生率为指标,可确定原生质体制备最佳条件。

⒋ 融合子的选择 
  融合子的选择主要依靠两个亲本的选择性遗传标记,在选择性培养基上,通过两个亲本的遗传标记互补而挑选出融合子。但是,由于原生质体融合后会产生两种情况,一种是真正的融合,即产生杂合二倍体或单倍重组体;另一种是暂时的融合,形成异核体。两者均可以在选择培养基上生长,一般前者较稳定,而后者不稳定,会分离成亲本类型,有的甚至可以异核状态移接几代。因此,要获得真正融合子,在融合体再生后,进行几代自然分离、选择,才能确定。 

  

⒌ 灭活原生质体融合技术在育种中的应用 

  灭活原生质体融合技术是指采用热、紫外线、电离辐射以及某些生化试剂、抗生素等作为灭活剂处理单一亲株或双亲株的原生质体,使之失去再生的能力,经细胞融合后,由于损伤部位的互补可以形成能再生的融合体。灭活处理的条件应该适当温和一些,以保持细胞DNA的遗传功能和重组能力。例如,在一株链霉菌中,其原生质体用55 ℃热处理30 min,存活率为零,种内单亲株灭活融合,能够得到融合子,而处理时间为60 min时,则得不到融合子。 
  ⑴ 单一亲株灭活 该方法可以采用灭活野生型亲株的原生质体,与另一带有营养缺陷型标记的非灭活亲株融合,然后筛选原养型重组体。例如有人在小单孢菌中用热灭活野生型亲株的原生质体,与另一营养缺陷型耐链霉素亲株融合,在再生群体中分离到的原养型菌株有80%为链霉素耐药菌。一般认为,被灭活的亲株在融合中起遗传物质供体的作用。 
  ⑵ 双亲株或多亲株灭活 常规的杂交育种和原生质体融合,一般都要用诱变方法给双亲株进行遗传标记,这不仅要耗费很大的人力和时间,并且往往对亲株的生产性能有重大的不利影响。双亲株原生质体灭活,只要其致死损伤不一致,就有可能通过融合而互补产生活的重组体。有人将链霉素产生菌灰色链霉菌的高产菌株81-36、84-102和野生型菌株4.181、4.139四个亲株的原生质体等量混合后,均等分成两份,分别用热和紫外线灭活,然后进行融合,获得的融合子中有一株兼有生产菌株的效价高和野生型菌株的生长快的双重优点。该方法由于可以不用遗传标记等优点,在育种工作中已初见成效。

DNA重组技术

  体外重组DNA技术(或称基因工程、遗传工程)是以分子遗传学的理论为基础,综合分子生物学和微生物遗传学的新技术而发展起来的一门新兴技术。它是现代生物技术的一个重要组成方面,是20世纪70年代以来生命科学发展的最前沿。利用基因工程能够使任何生物的DNA插入到某一细胞质复制因子中,进而引入寄主细胞进行成功表达。因而,在遗传学上开辟了一条崭新的研究DNA序列和功能的关系及基因表达调控机制的渠道,在工业微生物学上提供了巨大地创造具有工业应用价值的生产菌株的潜力。 
  ㈠ DNA重组过程 
  体外重组DNA技术操作的对象是单个基因,它的发展应归功于以下几方面的发现:① 在细菌中发现了染色体外能自主复制的质粒,它们可作为分子克隆的载体;② 发现了许多识别序列不同的限制性核酸内切酶,使不同来源的DNA分子得以切割和连接;③ 在大肠杆菌中发现了质粒转化系统。 
  基因操作就是把外源DNA分子结合到任何病毒、质粒或其他载体系统中,组成新的遗传物质,并转入宿主细胞内继续繁殖的过程。通过DNA片段的分子克隆,① 可以从复杂的DNA分子中分离出单独的DNA片段,这是常规物理或化学方法难以办到的;② 可以大量生产高纯度的基因片段及其产物;③ 可以在大肠杆菌中研究来自其他生物的基因;④ 在高等动植物细胞中也可以发展和建立这种基因操作系统。 
  重组DNA技术一般包括四步,即目标DNA片段的获得、与载体DNA分子的连接、重组DNA分子引入宿主细胞及从中选出含有所需重组DNA分子的宿主细胞。作为发酵工业的工程菌在此四步之后还需加上外源基因的表达及稳定性的考虑。 
  ⑴ 基因的分离 DNA的提取通常包括去垢剂(如SDS)裂解细胞壁,用酚和蛋白酶去除蛋白质,核糖核酸酶去除RNA,以及乙醇沉淀等步骤。但从总体DNA中分离特异的目的基因,则是相当困难的,主要有物理分离法、互补DNA(cDNA)分离法和“鸟枪”法等。 
  ⑵ DNA分子的切割与连接 DNA分子的切割是由限制性核酸内切酶来实现的。限制性核酸内切酶主要是从原核生物中分离的,可分为三类。在分子克隆中应用的主要是Ⅱ类限制性核酸内切酶,其分子量较小,在DNA上有各种不同的识别顺序,被称为分子手术刀。它不仅对切点邻近的两个核苷酸有严格要求,而且对较远的核苷酸顺序也有严格要求。限制酶的识别顺序通常为4~6个核苷酸,这些位点的核苷酸都作旋转对称排列。DNA片段的连接主要通过限制酶产生的黏性末端、末端转移酶合成的同聚物接尾以及合成的人工接头等,利用DNA连接酶来实现。大肠杆菌的DNA连接酶和T4噬菌体感染大肠杆菌产生的T4DNA连接酶,都能修复互补黏性末端之间的单链缺口。T4连接酶还能连接平末端的双链DNA分子或连接上合成的人工接头等。 
  ⑶ 载体 能够克隆外源DNA片段并能在大肠杆菌中繁殖的载体有四种类型:质粒(plasmids)、噬菌体λ、黏粒(cosmids,柯斯质粒)和单链噬菌体M13等。这四类载体大小、结构以及生物特性各不相同,但具有以下的共同点:① 能在大肠杆菌中自主复制,在共价连接了外源DNA片段后仍能自主复制,即载体本身就是一个单独的复制子;② 对某些限制酶来说只有一个切口,并在酶作用后不影响其自主繁殖能力;③ 从细菌核酸中分离和纯化很容易;④ 在宿主中能以多拷贝形式存在,有利于插入的外源基因的表达,能在宿主中稳定地遗传。 
  ⑷ 引入宿主细胞 外源DNA片段与载体连接形成的重组体必须进入宿主细胞才能进一步增殖和表达。以质粒为载体的重组DNA以转化的方式进入宿主细胞;以噬菌体为载体的重组DNA(不带包装蛋白)则以转染的方式进入宿主细胞;经体外包裹进噬菌体外壳的噬菌体载体重组子或柯斯质粒,则以转导的方式进入宿主细胞。 
  ⑸ 重组体的选择和鉴定 从转化、转染或转导的受体细胞群体中选择被研究的重组体,一般分两步:① 根据载体的遗传标记等选择出含有重组分子的转化细胞;② 进一步根据外源DNA(目标基因)的遗传特性进行鉴定。鉴定转化细胞的方法主要有:遗传学方法、免疫化学方法和核酸杂交方法等。 
  ⑹ 外源基因的表达 外源基因引入受体后,能否很好地表达,表达所形成的外源蛋白能否分泌或到达催化反应的场所等,是关系到能否工业化应用的问题。影响外源基因表达的因素主要表现在以下几个方面:转录水平上,启动子和受体细胞中RNA聚合酶的统一;翻译水平上,mRNA的核糖体结合部位与受体细胞核糖体的统一;外源基因插入方向对表达的影响;转录后修饰和翻译后修饰等。其中主要集中在转录、翻译及修饰三方面,任一步的失效均造成表达失败。 
  随着重组DNA技术的发展,将高等生物的基因克隆到大肠杆菌中,由大肠杆菌发酵生产人胰岛素、人生长激素和干扰素等高附加值药物产品已工业化生产。同时,在微生物发酵生产的其他产品中,重组DNA技术对产量的提高及性状的改良等也得到了广泛的研究和应用。

生物群体生长的规律

  这里将描述分批培养、同步生长、补料分批培养、连续培养、高密度细胞培养和双菌或多菌培养条件下微生物群体的生长情况。 
  1.分批培养(batch culture)
微生物在化学成分一定的培养基中进行分批培养,其生长速度将随时间而发生有规律性的变化。 
  (1)微生物的生长曲线:在微生物分批培养过程中定时取样,测定单位体积里的细胞数或重量,以单位体积里的细胞数或重量的对数为纵坐标,以培养时间为横坐标作图,就可以得到如图3-10所示的微生物繁殖或生长曲线,并表明前五个生长阶段的菌龄分布状态。

  根据微生物分批培养过程中生长繁殖速率的变化,可把分批培养的全过程分为若干阶段。普通重要的阶段为迟滞期、对数期、恒定期和衰亡期。图的左上角表示相应生长阶段的细胞菌龄分布密度。 
  (2) 分批培养各生长阶段详细说明 
  a.迟滞期(lag phase)  这是培养基接种之后开始的一个适应期。当微生物从一种环境进入新的培养环境时,重新调整其小分子和大分子的组成,包括酶和细胞结构成分,因而又有调整期之称。这个时期表现细胞数不变。当接种量少或微生物活力低时,会有一种生长停滞的现象。 
  迟滞期的微生物有下列生理特性:菌体内物质量显著增长,菌体体积增大或伸长;代谢机能非常活跃,为适应环境,可能产生特异的酶,生长速度逐渐加快:对外界理化因子(如NaCl、热、紫外线、x-射线等)的抵抗能力减弱:迟滞期的长短与菌种、菌龄、培养条件等有密切关系。用合适菌龄的种子或培养基培养条件可以缩短延迟期。一般而言、细菌、酵母菌的迟滞期最短,霉菌次之,放线菌最长。 
  b.对数期(exponential growth phase) 裂殖或芽殖单细胞微生物经过对新环境的适应阶段后,生长非常旺盛,细胞数以几何级数增长的阶段。细菌在这个生长期的生长就接近于前面用数学方法描述的理想生长状态。因此对数期是生长曲线中趋于直线状的那段时期。 
对数期微生物的生理特征是:这时养分、空间充裕,排出的代谢物浓度还不足以影响生长,所以为高速生长。若培养基及培养条件适当,生长速度会更快;该阶段前期的细胞对理化因素仍较敏感,而且菌体大小均匀,单个存在的细胞占多数。因此在研究微生物的代谢和遗传能时,宜用这个时期的细胞;该生长后期的细胞作为种子,接种合适的发酵培养基可以缩短延迟期。在分批培养中,生长速度常受某种限制性的营养物质的影响。这种限制性物质通常是碳源或能源(如葡萄糖)。在营养物质一定浓度范围内,微生物的生长速率是随营养物质浓度的增加而增加的,但超过一定浓度时生长速度便不再增加。反之,随着限制性营养物质浓度的下降,微生物的生长速率也按一定规律下降。 
  c.恒定期(stationary phase) 由于营养物质(包括限制性营养物质)的逐渐消耗和有生理毒性的代谢物质在培养基中的积累,以及其它条件(如pH、氧化还原电位等)对微生物生长不利的变化,到对数末期,微生物生长速度降低,繁殖率与死亡率逐渐趋于平衡,活菌数基本保持稳定,从而进入恒定期,该时期可以维持相当长的时间。由于不少代谢产物特别是次级代谢产物都在该阶段大量合成,所以该阶段对工业发酵是很重要的。 
  恒定期微生物的生理特征是:细胞分裂速率降低,细胞质内积累细胞贮存物,如糖源、脂肪、多聚β-羟基丁酸和多聚磷酸盐(polymetaphosphate)等。大多数产芽孢的细菌则在此时产生芽孢;代谢活动继续进行,并保持相当水平;此时期的长短因菌种和培养条件而异。如果生产需要,可以在菌种或工艺上采取措施,设法延长这个时期。 
  d.衰亡期(decline phase) 恒定期的后期,由于细胞死亡率的逐渐生长,以致明显 
超过新生率,虽然培养液浊度变化不大但活菌数明显下降,从而进入衰亡期。 
  衰亡期微生物的生理特征为:细胞内颗粒更明显,出现液泡,细胞长出现多种形态,包 
括畸形或衰退形;因细胞本身所产生的酶和代谢产物的作用因而使菌体分解死亡;衰亡期与其它各期比较相对地长,其时限决定于微生物本身遗传性能以及环境条件。 
  以上是单细胞微生物正常生长所经过的各个生长期。丝状微生物(霉菌、放线菌)稍有差异,主要是对数期生长不如细菌和酵母那么明显。

2.同步生长(synchronous growth)
  设法使群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中,然后分析此群体的各种生物化学特征,从而了解单个细胞所发生的变化。这种通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的状态,就称同步生长,图3-11和表3-23对此进行了图示和描述。
  获得细菌同步生长的方法主要有两类,其一是通过环境条件来诱导同步性,例如用变换温度、光线或对处于稳定期的培养物添加新鲜培养基等;其二是通过物理学方法从随机的、不同步细菌群体中选择出同步的群体,它一般可用选择性过滤或梯度离心法来达到。在这两类方法中,由于诱导法可能造成与正常细胞循环周期不同的周期变化,所以不及选择法好,
这在生理学研究中尤为明显。
  在选择法中根据某些细菌会紧紧地粘附在硝酸纤维微孔滤膜上的原理,设计了一个具体的选择方法:将非同步的细菌液体培养物通过微孔滤膜,让细胞吸附于其上;然后将滤膜反置,再以新鲜培养液滤过。这时,一些未粘牢的细胞先被冲洗掉,接着脱落到培养液中的都是那些新分裂形成的细胞,于是就获得了同步生长。  无论用哪类方法,每次处理后的微生物最多只能进行同步分裂4代,有时仅有一代。这是因为在群体中每个细胞的分裂时间在很大程度上总是不一致的,因而不可能得到永远是同步分裂的培养物。

3. 补料分批培养(Fed-batch culture)

  在生产实践中,完全封闭式的分批培养或纯粹的连续培养较为少见,更多见的是两者的 
折中形式——补料分批或流加发酵。 
  补料发酵是根据菌株生长和初始培养基的特点,在分批培养的某些阶段适当补加部分配料成分或碳源,以提高菌体或代谢产物的产率。补料分批发酵的特点有:
  (1)可以减弱底物和代谢产物的控制 微生物的生长会受到高浓度底物和逐步过量产生例代谢产物的抑制,若将初始底物浓度降低,就会限制菌体密度和产物浓度的提高。但采用间歇补料,通过不断的流加限制性底物就可克服该缺点,可以避免葡萄糖效应对微生物生长和产物积累的影响。流加补料还可稀释降低代谢产物浓度,可减轻其抑制生长作用。 
  (2)增加次级代谢产物的产量 次级代谢产物的合成常常在生长平衡期才开始合成,与稳定期的细胞密度和延续时间密切相关。但间歇发酵的平衡期比较短,因营养物质已大量消耗,可同化量很少,很快就进入衰亡期。通过补料可延长平衡期,可增加次级代谢产物的产量。 
  (3)可以提高发酵的细胞密度 补料发酵时不断地向发酵罐补偿限制性底物,微生物始终能获得充分的营养,菌体密度就可以增加,发酵工艺的合理改进,细胞密度可以达到10%干细胞以上,可大大提高产率。 
  (4)可以恒定培养条件 发酵过程培养环境条件会随着代谢作用的进行而变化,如培养基的pH,这时可流加氨水或通氨来恒定pH,还补充了氮源。 
由于上述优点,操作也方便,所以补料分批培养在发酵工业中得到了广泛的应用。  4.连续培养(continuous culture)
  在分批培养和发酵时,微生物的生长和产物同时或分间段进行。若将新鲜的培养基连续加入均匀搅拌的培养物中,同时排出含有细胞和产物的发酵液,就可进行连续培养,并可在较长的时期内维持生长。而且,细胞浓度、比生长速率、培养环境(例如营养物和产物浓度)可不随时间而变化、维持稳定状态。这与培养环境不断变化的分批培养中的生长显然不同。所以连续培养为研究微生物对环境的响应以及在最佳环境条件下连续生产细胞和其它产物提供了一种独特的方法。 
  连续培养的一个重要特征是使微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。连续培养的方法大致可以分为两类,即恒化器(chemostat)法和恒浊器(turidostat)法。“恒化”指的是恒定的化学环境,“恒浊”指的是反映细胞浓度的浊度恒定。 
  恒化器和恒浊器装置相似,都有一个恒定体积的培养容器,并且都是依靠流加和排出来维持培养槽内液体体积的恒定的,只是培养过程中对微生物生长的控制方法不同。

  恒化器法与恒浊器法都是在一固定容器内培养微生物,当微生物进入对数生长期时,要不断地加入新鲜的培养基,同时流出培养物,以使培养器中培养物的体积保持恒定。恒化器是通过调节培养液的流速来进行控制的。其最基本的操作条件是,由流速决定的稀释速率不等于或不超过微生物的最大比生长速率。 
  恒浊器可以在恒化器的基础上添加浊度控制仪而构成。 
  恒化器法是把微生物增殖所必须的一种营养源(如碳源、氮源、无机盐类、溶解氧等)作为限制条件(单一的限制性基质),通过控制其供给速度来限制微生物的增殖速度,从而实现连续培养的。由于营养料的最适供给速率比较难求,因而常以自控系统进行调节。在恒化器中进行连续培养时,在预定的培养基中,除了一种营养物外,其余都超过用于合成所要求浓度的细胞所需要的量,这一种营养物质在这里叫限制性基质。生长所需要的任何一种营养物都可以作为限制性基质,这样就给研究者通过调节生长环境来控制正在生长中的细胞生理特性带来了很大的灵活性,并使恒化器成为一种广泛采用的连续培养装置。 
  恒浊器法是通过流加新鲜培养基,以保持培养器中微生物细胞的密度,从而实现连续培养的。微生物的密度若能表现为培养液的浊度,而浊度可以转变为光电信号,此信号与对应于预定浊度的光电信号比较,即可发出控制信号,使流加新鲜培养基的电磁阀开或关。由于培养器体积用溢流装置维持恒定,而且容器里的物料是均匀混合的,所以当电磁阀打开时,有些细胞从容器内溢出,培养物被稀释,浊度下降。流加到一定程度,当浊度产生的光电信号比预定的浊度光电信号小时,电磁阀即自动关闭。容器内微生物的生长又使浊度上升,上升到预定值,电磁阀又打开…如此不断地开、关电磁阀,从而实现恒浊控制。此法不适用于霉菌、放线菌等形成菌丝的微生物。   

发酵工业上采用多罐串联连续培养的方法,可以大大缩短发酵周期,提高设备的利用率。

 

5. 高密度细胞培养(high cell density culture)

  一般是指在液体培养中细胞含量超过常规培养10倍以上的发酵技术。在采用毕赤酵母高密度细胞发酵时,生物量达到100g干重/L,代谢物的产量也大为提高,所以该技术能大大提高生产产率,并提高产物的分离和提取效率。但要达到高密度细胞培养,不仅要选育适合的菌种,而且在培养工艺技术上必须作相应的改进,如培养基的成分和比例的优化;补料技术的采用;溶氧浓度的提高和防止有害产物的生成等。图3-13是采用毕赤酵母高密度细胞发酵的对比照片。

6. 双菌或多菌培养 
  现代发酵工业以纯种发酵为主,而传统的固态白酒和酱油的发酵都是多菌培养发酵的结果。在自然界微生物之间的共生与互生关系也是双菌与多菌共同生存的常例,这种关系反映了微生物存在着代谢“接力捧”的依赖状态,能相互改善生存条件。 
  维生素C的二步法生产是发酵工业双菌发酵的典型例子。如采用欧文氏菌(Erwiniasp.) 和棒状杆菌(Corynebacterium sp.)进行串联发酵,先将D-葡萄糖转化成2,5-二酮基-D-葡萄糖酸,再进一步转化产生2-酮基-L-古龙酸。另一路线是从葡萄糖高压加氢制成的D-山梨醇是发酵的主要原料,利用生黑葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter melanogenus)或弱氧醋酸杆菌(Acetobacter suboxydans)先进行第一步发酵,所生成的L-山梨糖(醪液)于80℃加热几分钟后再加入消过毒的辅料(玉米浆,尿素及无机盐等),即可开始第二步的混合菌株发酵.初期pH约为7.0,两株菌生长均很正常;当作为伴生菌的芽孢杆菌开始形成芽孢时,产酸菌株(Gluconobacter oxydans)开始产酸。 
  许多发酵是纯菌株无法实现的,只有混合菌株才能完成,所以采用混菌培养有可能获得新型的或优质的发酵产品,有时比单菌培养反应更快、更有效,更简便,当然混菌培养的反应机制较复杂。

三、微生物生长的测定 
  描述微生物生长,对不同的微生物和不同的生长状态可以选取不同的指标。通常对于处于旺盛生长期的单细胞微生物,既可选细胞数,又可以选细胞质量作为生长指标,因为这时这两者是成比例的。对于多细胞微生物的生长(以丝状真菌为代表),则通常以菌丝生长长度或者菌丝重量作为生长指标。

  常用的测定或估计微生物生长的方法有下列几种(表3-24)。
(一)计数器法亦称血球计数板法(适用于单细胞) 
  对酵母用Thoma血球计数板,对细菌用Petriff-Hausser计数器或Helber计数器,直接在显微镜下计数。这些计数器的底面都有棋盘式刻度,可以数一定面积内的菌数。Thoma计数小室和细菌计数小室的深度分别为0.1mm和0.02mm。每个方格的体积分别为2.5x10-4mm3和5x10-8mm3。Petroff-Hausser计数小室的玻璃要薄一些,以便于进行暗视野照明。 
  对细菌来说,视野照明的强弱也是重要的。不管是计数盘底上的菌还是上面存在的少数细菌,都要操纵微调装置,看清楚后加以计算,不要漏掉。对能运动的细菌,一般可以设法用4%聚乙烯醇停止其运动。

(二)平皿活计数法 
  这是采用平皿涂布或混合试样和培养基长出菌落测定活菌数的方法。其操作过程是试样 
的逐级稀释和在培养基上涂布或试样与融化培养基混合,培养后计数菌落数,由于每一菌落系由一个细胞繁殖而成,故可按稀释度与加入试样量计算出活菌数。不过也并非所有的微生物都能在人工培养基上生长成菌落,这是个限制,也是必然要逐步解决的重要课题。

  平皿活计数法的稀释倍数很重要,因为每个平皿上长出的菌落数对数据的正确性影响很大,一般要求一个直径9cm的平皿上长出30-300个菌落,两稀释倍度之比接近1为佳。

注: 
   1.以选取菌落数30、300之间的培养皿作为菌落总数测定的依据。酵母、细菌可采用菌落数偏大者,而霉菌则应选取菌落数偏小者。如:根、毛霉菌偏多,可于培养基内加入0.1%去氧胆酸钠,以限制它们迅速扩展。总之,菌落计数应以菌落间各个分开为度(例1)。 
  2.若有两个稀释度,其生长的菌落均在30~300之间,则应视两者之比如何来决定。若其比值小于2,则应取其平均值;若大于2,则取其较小数(例2及例3)。
  3.若所有的稀释的平均菌落数大于300,或重行再次稀释分离培养,或取稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数为菌落数(例4)。 
  4.若所有的稀释度的平均菌落数均小于30,或重行再次稀释分离培养或取稀释度倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数,定为菌落数(例5)。 
  5.若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间,则以最接近30成300的平均数乘稀释倍数(例6)。 
  6.菌落数在100以内,按实有数记录,若大于100时,采用二位有效数,二位有效数后的数值,以四舍五入法计算。一般以10的指数表示。


常用于大肠杆菌最可能数(MPN)液体试菅稀释法

  将检样以无菌操作接种于乳糖胆盐发酵管内,采用3个稀释度正[1m1(g)、0.1m1(g)和0.0lml(g)],每稀释度3管。置44±0.5℃水浴内,培养24±2h,经培养后,若乳糖胆盐发酵管有产气者,则进行证实试验。将所有产气发酵管,分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃培养18-24h,并同时接种蛋白胨水,置44±0.5℃培养24h。在上述平板上观察有无典型菌落生长,并做革兰氏染色镜检。在蛋白胨水内加入靛基质试剂约0.5ml,观察靛基质反应。凡靛基质阳性,平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100m1(g)粪大肠菌群的最可能数。
(四)比色(比浊)法 
  细胞悬浮液的浑浊度通常采用光波长为600~700nm的分光光度计测定。当应用浑浊度测量细胞重量时,很重要的一点是发酵产物和培养基的成分不能吸收在所用的波长范围内的光。如果在培养中有许多非细胞固体存在,那么这种技术是不能用的,除非预先除去非细胞颗粒(如家稀盐酸除去CaCO3)。当浑浊度用于估算菌丝体微生物时,在分析之前必须将样品捣碎均匀。 
(五)干重测定法 
  1.单细胞微生物的测定 
  细胞培养液经离心洗涤后转移到适当的容器内(尽量轻些的容器为好),分别在100~105℃干燥箱干燥、低温低压干燥(40~80℃)或红外线适温干燥后称重。 
  2.多细胞微生物的测定 
  将菌种接到液体培养基内做震荡培养,经一段时间后,过滤收集菌丝,洗涤后,将菌丝置于80~100℃烘箱中烘干到恒重,或在低温(60℃)下减压干燥后测菌丝量。在固体培养基上,当培养的菌丝生长到一定阶段后,亦可经短时高压灭菌,使琼脂溶化,折出菌丝,用热蒸馏水洗净,再烘干测干重。高压灭菌可能会影响菌丝内某些物质的含量,需要适当控制时间和温度。这样所得到的结果还是相当准确的。 
(六)菌丝长度测定法 
  通常以菌丝生长的长度或菌丝增加的重量作为丝状真菌生长的指标。在固体培养基上培养丝状真菌时,以测量菌丝生长长度为主。最简单的方法是将丝状真菌接种在玻璃培养皿内固体培养基的中央,在一定时间内测定菌落的直径或面积。对生长速度快的丝状真菌,可以每24小时测量一次;对生长缓慢的丝状真菌,可数日测量一次,直到菌落掩盖全皿为止。由此可求出菌丝的平均生长速度。据此绘制生长曲线。 
  这种方法的缺点是仅能测菌落的直径或面积,而不能测量菌落的厚度和生长在培养基内的菌丝量,因而不能反映菌丝的总量。

(七)细胞堆积体积的测法 
  把细胞悬浊液装在毛细沉淀管或刻度离心菅中,在一定条件下进行离心,根据收集的沉淀体积计算出菌量。用这个方法时,因为除细胞本身的体积外,细胞与细胞之间的空间体积也包括在内,所以通常不规则的菌丝难以采用这种方法。 
  工厂测定细胞重量常用的方法是测定细胞堆积体积。 

(八) 膜过滤培养计数法 
  将细胞浓度很稀的一定体积的待测液通过一定孔径膜的吸滤装置,然后放在平皿培养基上培养,就可获得活细胞数。

四、营养物质的浓度及性质对微生物生长速率的影响 
  在典型的分批发酵(单细胞裂殖微生物细菌的分批培养)中,微生物在对数期的比生长速率μ是个常数,它与营养浓度的改变无关。但是生长速率(dX/dt)就象化学反应速率一样是化学组成浓度的函数。 
即:  dX/dt=μX
  在这种情况下,这些化学组分就是基础营养或限制性基质。由前述,Monod公式可知,生长速率与限制性基质浓度之间的关系经验表达式为: 
μ=μmax S/KS+S
式中 μ——生长速率 
μmax—— 在指定温度和pH条件下的最大比生长速率,即在过量营养条件下达到的比生长速率 
S——限制性基质的浓度 
KS——当比生长速率为最大比生长速率一半时限制基质的浓度 
KS值与微生物对该基质的亲和力成反比。一般来讲,多数生长基质的KS值是很小的,如糖是2~20μM,氨基酸是2μM。同一种基质对不同的微生物的KS也不同。这意味着在正常的分批培养中,直到生长结束比生长速率都接近μmax.
  当S>10KS时,μ≈μmax;当S<10KS时,比生长速率为基质浓度的函数。因为KS一般都很小,所以在对数期微生物的比生长速率是恒定的。从对数期到稳定期的过渡通常是十分迅速或突然的。因为从这一点以后剩余基质的浓度就很低了,高浓度的细胞很快地利用残留的基质。 
  Monod模型虽属于经验观察,但它与米氏(Michaelis-Menton)酶动力学模型相似,并且可以假设单一限制速率的酶所催化的步骤控制着生长速率,因而可以认为它是合乎道理的。 
  某些单一的碳源与其它碳源相比,能使细胞维持比较高的生长速率。这表明每种化合物能以不同的程度供给细胞主要反应所需要的能量和生产所需要的碳代谢物。增加培养物能够利用的基质的数量(如添加氨基酸混合物),可使细胞生长速率进一步上升。这是因为微生物使用事先合成的前体(指蛋白质等),可省下前体合成所需要的能量,并使这些能量转用到细胞生长上去。如营养吸收,核酸、蛋白质、膜、细胞壁等的合成。因此,实验室经常采用改变培养基营养成分的方法来获得不同的细胞生长速率。

五、多种碳源及复合培养基存在下的微生物的生长 
  图3-10所示的生长曲线代表微生物在单一碳源和能源培养基中的生长模型。当有一种以上的碳源和能源同时存在时,通常在一段时间内仅有一种碳基质首先被微生物所利用。菌体的生长速度与这种碳源的性质密切相关,一些微生物在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长,会产生“二次生长”。葡萄糖首先被利用,用完才使分解乳糖的酶解担遏,从而开始利用乳糖。 
  因此培养基中许多碳基质同时存在,则将得到一系列生长阶段(不止二次生长)。若在一种复合的培养基中,不仅有多种碳源,而且有各种各样的化合物如氨基酸、核苷酸、维生素类和其它代谢中间物,那么在生长过程中,这些细胞的酶体系要经过多次变化。当细胞在已加入中间物的培养条件下生长时,细胞就不会合成形成这些中间物的酶系统。只有等这种中间物用完后,才会合成该酶系统。因此,如果在复合培养基中生长,细胞连续地耗尽有用的中间物,则随着时间的推移,需要合成的酶系统就越来越多。当预先加入的中间物和最易利用的营养耗尽后,生长速率就回降低。 
  实际生产中均使用复合培养基。微生物在复合培养基中的二次生长曲线如图3-18所示。

  在这里细胞不是呈现指数生长。事实上曲线是由一系列指数曲线所组成的,只是其斜率不断随时增加而减小罢了。这种形式的生长和产物形成曲线,在用复合培养基进行的工业发酵生产中是最常见的。